为了评价纳米乳作为佐剂对恶性疟疾人工重组蛋白疫苗M.RCAg-1免疫原性的影响,将纳米乳佐剂与M.RCAg-1相配伍,于第0、14、28 d肌肉注射免疫小鼠,抗原量为20 μg/只。第3次免疫后10 d,眼球取血并取脾细胞。采用ELISA法检测小鼠血清特异性IgG抗体水平、抗体亚类及其对抗原单表位的识别,用间接免疫荧光反应(IFA)检测抗体对恶性疟原虫天然蛋白的识别,用ELISPOT法检测小鼠脾淋巴细胞免疫应答水平。结果显示疫苗佐剂组小鼠血清中抗M.RCAg-1的抗体水平可达1∶10⁸;疫苗佐剂组产生的特异性IgG抗体以IgG1为主;疫苗佐剂组抗体对抗原单表位和天然虫体的识别效果显著。各表位和蛋白诱发免疫小鼠分泌IFN-γ的特异性淋巴细胞克隆数高于分泌IL-4的特异性淋巴细胞克隆数。结果提示纳米乳作为恶性疟疾疫苗M.RCAg-1的佐剂,能够显著提高机体的体液免疫和细胞免疫应答水平。

将抗日本血吸虫SEA纳米抗体固定于镀金的石墨烯薄膜上,制备一种新型的阻抗型免疫传感器检测日本血吸虫循环抗原。使用扫描电镜、原子力显微镜和拉曼光谱对石墨烯薄膜及石墨烯/金复合材料进行了表征,并对制备的免疫传感器的特异性和灵敏度进行了测试。结果显示,所制备的免疫传感器具有较好的特异性和灵敏度,与曼氏裂头蚴、刚地弓形虫、颚口线虫、简单异尖线虫、华支睾吸虫和卫氏并殖吸虫抗原没有交叉反应,检测日本血吸虫可溶性虫卵抗原达到0.01 ng/mL水平;血吸虫病患者血清的阳性检出率为66.7%,优于现有试剂盒ELISA法56.7%的检出率,与ELISA的符合率为90%。该免疫传感器检测日本血吸虫循环抗原具有较高的灵敏度和特异性,制作方法简便、快速等优点,具有较好的应用潜能。

以新孢子虫Nc-5 基因为目的基因,建立检测新孢子虫的PCR方法并初步应用。根据GenBank 发布的新孢子虫Nc-5特异性基因序列设计引物, 以新孢子虫基因组DNA 为模板,利用梯度PCR法优化反应条件,建立PCR检测方法。以弓形虫、疟原虫、牛环形泰勒虫、包拉米虫和马尔太虫为模板进行扩增以验证建立方法的特异性。采用紫外分光光度计测定新孢子虫基因组DNA浓度和纯度,倍比稀释后的DNA进行PCR扩增,产物电泳分析确定建立方法的敏感性;选择高浓度和低浓度的新孢子虫基因组DNA重复检测3次,分析建立方法的重复性和稳定性。利用该方法对实验室建立的小鼠感染模型进行初步应用,评价建立方法的检测效果。结果成功建立新孢子虫的核酸扩增检测方法,扩增序列与GenBank(LN714476.1)中Nc-5 基因序列一致性为100%,建立的新孢子虫核酸扩增检测方法与弓形虫、疟原虫、牛环形泰勒虫、包拉米虫和马尔太虫均无交叉反应,最低能检测新孢子虫DNA浓度为0.5788 pg/μL,应用该方法检测感染新孢子虫的BALB/c小鼠模型,可在肺和脑组织中检测到新孢子虫的感染。结果表明,建立的新孢子虫核酸扩增检测方法有效,并为后续研究奠定基础。

为找出中国内蒙古地区和蒙古扎门乌德两个包虫病高发区肝包虫分布特点和流行特征,于2012-2015年在内蒙古地区选取二连浩特、苏尼特左旗、苏尼特右旗、乌海、阿拉善、呼伦贝尔、东胜、包头及蒙古扎门乌德地区调查包虫病患病情况,结果发现, 内蒙古调查地区肝包虫阳性率为11.7%,蒙古扎门乌德调查地区阳性率为20.7%,内蒙古地区患病率明显低于蒙古扎门乌德;但内蒙古地区人群相关危险行为高于蒙古扎门乌德地区。内蒙古苏尼特右旗阳性率最高(29.4%),包头市最低。

2016年全球寨卡病毒病疫情暴发,使我国面临一定的输入传播风险。本研究基于2016年全球寨卡病毒病报告疫情数据、全球国际航班客流量数据和我国云南和广西边境口岸分布等数据,通过计算输入风险指数评估我国主要城市寨卡病毒病输入风险。应用生态位模型预测中国当前埃及伊蚊、白纹伊蚊的分布区域,结合内地主要城市寨卡病毒病输入风险指数、埃及伊蚊或白纹伊蚊的分布概率等数据,计算主要城市寨卡病毒病输入后继发本地传播风险指数,评估本地传播风险。研究表明北京、上海和广州经国际航班输入寨卡病毒病的风险高;云南省德宏州、临沧市和西双版纳州以及广西防城港市和北海市经陆运口岸输入的风险较高;需加强口岸检疫,及时发现病例。仅考虑埃及伊蚊在该病传播中发挥作用,海口、三亚和湛江存在寨卡病毒病本地传播风险。云南省德宏州、临沧市两地在3-11月份如发生陆运口岸输入寨卡病毒病,存在经埃及伊蚊引起本地传播的中等风险。这些城市需要加强人群和伊蚊的监测,以利于早发现疫情、及早采取防蚊灭蚊等防控措施。

本研究建立了一种简单、快速、准确的寨卡病毒可视化逆转录环介导等温扩增(RT-LAMP)检测方法。在线设计3套LAMP引物,利用实时浊度仪筛选最佳引物,加入羟基萘酚蓝,评估可视化RT-LAMP检测方法的灵敏度和特异性。建立的可视化RT-LAMP方法可检测的最低浓度为10¹ copies/μL,高于普通PCR和荧光定量PCR 1～2个数量级;同时,该方法不与其他虫媒病毒产生交叉反应。该方法可为虫媒监测和临床诊断提供实验依据。

为阐明云南省西南边境地区登革2型病毒(DENV-2)流行株的全基因组序列特征及流行病学特点,采用C6/36 细胞培养法分离病毒,用RT-PCR法扩增新分离DENV-2的全基因组序列,采用ClastalX1.83和MEGA6等生物信息学软件进行核苷酸同源性及系统进化分析。结果从登革热患者血清中分离到10株DENV-2,其中德宏州瑞丽市6株(2013年3株和2015年3株),西双版纳州景洪市2015年4株。经RT-PCR和序列测定,获得这10株DENV-2的全基因组序列。基于结构蛋白和非结构蛋白基因的系统进化和同源性分析表明,这10株病毒中5株为亚洲基因Ⅰ型(Asian Ⅰ Genotype, AG-Ⅰ),5株为全球基因型(Cosmopolitan genotype, CG)。其中2013和2015年瑞丽流行株均为AG-Ⅰ,景洪市2015年流行株均属CG,它们均与东南亚相同基因型流行株具有较高的同源性和较近的亲缘关系。云南株与DENV-2原型株(New Guinea-C)的E和NS5基因核苷酸同源性分别为93.38%～93.77%和92.80%～94.74%。所有云南株和东南亚参考株与New Guinea-C株在结构蛋白或非结构蛋白的氨基酸位点均存在一定程度的改变。本研究证实,云南省西南边境地区存在DENV-2两种基因型流行,瑞丽和景洪流行株分别为AG-Ⅰ和CG,但它们的输入来源均为相邻东南亚国家。云南株与DENV-2原型株New Guinea-C株间存在明显差异,但决定病毒抗原、致病性和毒力的关键位点未发现明显变化。

本文探讨了中国2011—2015年登革热疫情的时空分布特征。收集整理中国各省2011—2015年登革热疫情监测数据,应用ArcGIS 9.0软件建立地理信息库,利用SaTScan7.0软件进行时空聚类分析,确定登革热疫情发生的时空热点区域,再对该热点区域进一步进行疫情分析。中国2011—2015年登革热疫情呈显著的聚集性分布。一级时空聚类区为广东省2014年10月;存在2个二级聚类区,一个是云南省2015年10月,另一个是江西、福建省2014年9月。登革热的热点区域广东省2013—2015年的时空聚类分析显示,一级聚类区为广州市、东莞市和佛山市,聚类时段为2014年9—10月;二级聚类区为广东省东部的潮州市,聚类时间为2015年9月。我国2011—2015年登革热疫情主要分布于东南沿海区域(以广东省为主)、西南部地区(以云南省为主)。广东省2013—2014年登革发疫情主要聚集于该省的中部地区,2015年高发聚集区东移至该省东部。

探讨Aalb_56 ku基因在白纹伊蚊(广州株)不同组织中的表达差异;对唾液腺中Aalb_56 ku基因进行克隆表达并探索其免疫原性。采用实时荧光定量RT-PCR法对雌蚊中肠、脂肪体、唾液腺不同组织中Aalb_56 ku基因的表达差异进行分析。针对Aalb_56 ku基因序列设计特异性引物,以唾液腺RNA为模板获得56 ku全长基因序列,构建重组质粒并测序,将测序序列进行生物信息学和抗原表位预测分析。IPTG诱导表达,亲和层析法纯化重组蛋白;制备小鼠特异性抗Aalb_56 ku蛋白抗血清。结果显示, Aalb_56 ku在白纹伊蚊(广州株)唾液腺(SG)中高表达。克隆所获唾液腺56 ku基因全长1 593 bp,可编码530个氨基酸,信息学分析提示该基因含有信号肽序列,等电点为8.40,抗原表位预测提示含有23个表位。pET30a(+)-56 ku重组质粒可表达约56 kDa大小的融合蛋白,且呈包涵体形式表达,Western blotting鉴定具有His标签。纯化蛋白免疫Balb/c小鼠后可获得1∶100效价的特异性抗血清,提示该重组蛋白具有一定的免疫原性。

本文旨在探讨吉林省延边地区自然环境和动物体表蜱类分布及其消长规律,掌握其携带发热伴血小板减少综合征布尼亚病毒(Severe fever with thrombocytopenia syndrome virus, SFTSV)状况及传播病毒能力。2016年4～9月份按月采集延边州所辖8个县(市)自然环境中生长的蜱虫和放牧动物体表蜱虫进行形态学分类,对其进行构成分析。对其中部分蜱虫分组进行SFTSV核酸检测。SFTSV核酸检测方法采用了Real time RT-PCR和RT-PCR相结合的方法。结果共采集蜱虫3 446只,其中森林革蜱763只, 嗜群血蜱222 只,日本血蜱639只,长角血蜱515只,全沟硬蜱1 014只,其他血蜱 293 只;全沟硬蜱(29.43%)和森林革蜱(22.14%)为本地优势种。长角血蜱在图们市(70.88%)和珲春市(40.59%)分布较多。对部分蜱虫(1605只)SFTSV Real time RT-PCR检测结果总最低感染率为1.81%,分种最低感染率分别为嗜群血蜱8.65%、日本血蜱4.53%、长角血蜱1.59%。序列分析结果表明,本文检测到的SFTSV病毒与我国其他省份从患者身上分离到的大部分SFTSV有高度一致性(99%)且与2012年从浙江患者血清中分离到的SFTSV、2013年韩国国家疾病预防控制中心从人身上采集的长角血蜱中分离到的SFTSV处于同一分枝,把该病毒命名为YBHC-TICK1-2016/CHINA。