弓形虫感染可激发宿主产生Th1型免疫反应,因此研究弓形虫疫苗尤其需要关注系统性T细胞免疫应答与保护力的关系。本研究被弓形虫Pru株包囊口服感染BALB/c小鼠,成功建立了弓形虫慢性感染小鼠模型。慢性感染小鼠的脾细胞用弓形虫可溶性抗原刺激后可以产生特异性增殖。进一步分析发现弓形虫特异性CD3⁺ T、CD4⁺ T和CD8⁺ T细胞都可以产生IFN-γ。本研究建立的弓形虫慢性感染小鼠模型可以产生较强的系统性T细胞免疫应答,为弓形虫疫苗研制的效果评价提供重要参考。

DNA疫苗是将编码抗原的基因插入载体质粒中构成重组体,直接接种机体,在接种部位摄取表达并达到抗感染目的的一种疫苗。pCMV-Taq2B载体具有人巨细胞病毒(Human cytomegalovirus,CMV)高效启动子/增强子序列,可使目的基因在真核细胞中高水平稳定表达成为DNA疫苗载体。构建pCMV-Taq2B-Surface antigen 2(表面膜抗原2)(pSAG2)、pCMV-Taq2B-Dense granule protein 2(致密颗粒蛋白2)(pGRA2)及pCMV-Taq2B-SAG2-GRA2(pSAG2-GRA2)DNA疫苗并研究其免疫保护效果。将pSAG2、pGRA2、pSAG2-GRA2 DNA疫苗(实验组)、磷酸盐缓冲液(Phosphate buffered saline,PBS)、pCMV-Taq2B空质粒(对照组)分别肌肉注射BALB/c 小鼠,ELISA法检测血清IgG抗体水平。末次免疫后第28 d,各组每只小鼠经腹腔注射弓形虫速殖子1 000个,观察小鼠的生存时间。结果显示单基因疫苗pSAG2、pGRA2和双基因疫苗pSAG2-GRA2免疫组均能诱导产生特异性IgG抗体,且于末次免疫后第28 d达到最高值,此时单基因疫苗pGRA2(0.382±0.66)和双基因疫苗pSAG2-GRA2(0.548±0.137)免疫组吸光度值显著高于PBS(0.137±0.016)或pCMV-Taq2B(0.135±0.010)对照组吸光度值。免疫单基因疫苗pSAG2(14.3±1.8)、pGRA2组(13.5±2.1)小鼠存活时间(d)明显长于PBS(4.3±1.6)及pCMV-Taq2B组(4.1±1.3),且双基因疫苗pSAG2-GRA2组(19.6±2.4)小鼠存活时间明显长于单基因疫苗pSAG2组及pGRA2组。弓形虫双基因疫苗pSAG2-GRA2能够诱导小鼠产生抗弓形虫感染保护性免疫,其免疫保护性优于pSAG2、pGRA2单基因疫苗。

H9N2亚型禽流感病毒已经被证实可以传播到人类,对它存在的潜在危害已受到越来越多的关注。因此,研究安全而有效的H9N2禽流感病毒疫苗已迫在眉睫。为研究和缓艾美耳球虫作为活载体表达及运输禽流感病毒抗原的潜能,本研究构建了可稳定表达H9N2禽流感病毒HA1蛋白的转基因和缓艾美耳球虫。利用黄色荧光蛋白(YFP)及融合的乙胺嘧啶抗性基因(DHFR-TSm2m3)作为报告基因及筛选基因,我们将表达H9N2禽流感病毒HA1抗原的质粒载体核转球虫子孢子,接种鸡后在乙胺嘧啶药物的选择压力下进行筛选并连续传代获得转基因和缓艾美耳球虫系。利用染色体步移和免疫印迹证实了HA1基因的成功插入和表达;利用间接免疫荧光证实HA1蛋白定位于球虫子孢子细胞膜表面和头部。研究进一步发现,转基因球虫的繁殖力与野生球虫相当,感染后亦于第6 d达到排卵囊高峰。该转基因和缓艾美耳球虫株具有作为疫苗活载体的潜能。

微线体蛋白2(Microneme protein 2, Mic 2)是艾美耳球虫入侵宿主细胞时分泌的主要功能蛋白之一。本研究中,以抗柔嫩艾美耳球虫微线体蛋白2(EtMic2)单克隆抗体为检测抗体,利用间接免疫荧光实验(IFA)检测了Mic 2在柔嫩艾美耳球虫、和缓艾美耳球虫、斯氏艾美耳球虫和无残艾美耳球虫等不同种艾美耳属球虫的空间分布。结果显示,Mic 2在不同种艾美耳属球虫中均定位于子孢子的顶部(微线体部位),但表达强度存在差异。这提示Mic 2可作为研究艾美耳属球虫相关蛋白空间分布的“参照物”。

鸡的7种艾美耳球虫中,巨型艾美耳球虫免疫原性最强。为研究巨型艾美耳球虫激发宿主产生的免疫应答,我们检测了巨型艾美耳球虫3次感染后鸡只的抗体应答及细胞应答特征。ELISA检测显示,感染鸡只产生了显著高于未感染鸡只的特异性IgY和sIgA(肠道及胆汁)抗体;而酶联免疫斑点法(ELISPOT)检测显示,被感染鸡只脾脏中分泌IFN-γ的球虫特异性淋巴细胞的数量显著高于对照组。粪便中卵囊的检测则显示,第3次感染后的鸡只几乎无卵囊排出,证实巨型艾美耳球虫产生的免疫应答可对同源感染提供完全的免疫保护。

兔球虫专性寄生于兔消化系统(肝脏及肠道),所引起的兔球虫病对养兔业危害极大。兔球虫病对断奶后至3月龄的幼兔危害最大,本文用5 000个中型艾美耳球虫和无残艾美耳球虫卵囊分别接种30、50和70日龄的新西兰白兔,通过统计兔排出的球虫卵囊量来分析不同日龄幼兔的易感性。结果显示,中型艾美耳球虫感染时,70日龄兔卵囊排出总量仅为3.7×10⁷,明显低于30日龄(1.03×10⁸)、50日龄(6.5×10⁷)兔,且差异显著;而无残艾美耳球虫感染也得到相似的结果。同时,30日龄兔在感染后临床症状明显,精神萎靡,便秘、腹泻现象交替出现。该结果表明断奶前后(30日龄左右)幼兔对两种球虫的易感性最强。

和缓艾美耳球虫 Eimeria mitis 是7种鸡球虫中致病力弱的虫种,对于其免疫原性的认识至今仍有争论。本研究以和缓艾美耳球虫涿州株为研究对象,以初次免疫及二次免疫后鸡的卵囊排出量为标准评估了其免疫原性。同时利用ELISA检测了免疫后鸡群血清中球虫特异性IgY抗体的水平,并通过ELISPOT技术分析了二免后鸡群外周血单核淋巴细胞(PBMC)中分泌IFN-γ的特异性淋巴细胞的数量。结果显示,二次免疫后,鸡的卵囊排出量显著低于初次免疫,免疫组的血清特异性IgY抗体水平较低,而分泌IFN-γ的特异性淋巴细胞的数量较高。这些结果表明和缓艾美耳球虫涿州株具备良好免疫原性,且其激发宿主产生的保护性免疫以细胞免疫应答为主,有作为疫苗株的潜力。

肠艾美耳球虫是兔球虫中的主要致病虫种之一,充分研究其生物学特性对兔球虫病的防治有十分重要的意义。本文对肠艾美耳球虫张家口分离株的致病性和免疫原性进行了初步研究。利用3个剂量(1×10⁴、1×10⁵、1×10⁶)的肠艾美耳球虫张家口分离株孢子化卵囊感染35～45日龄无球虫兔,观察临床症状和体重变化,以研究其致病性;21 d后,再用1×10⁶个肠艾美耳球虫孢子化卵囊进行攻毒,监测体重变化和卵囊排出量,评价其免疫原性。结果发现,接种1×10⁴个卵囊,即可导致家兔出现临床症状,与空白对照组相比,日增重显著下降,更高感染剂量则会加重症状。攻毒后,免疫组增重未受影响,与空白对照组相比无差异,而不免疫攻毒组体重显著下降;同时免疫组的卵囊排出量显著低于不免疫攻毒组。结果表明肠艾美耳球虫张家口分离株对仔兔具有中等致病性;同时其免疫原性良好。因此可以把该株球虫作为原始株进行早熟虫株选育,并以此为基础,进行兔球虫病疫苗的开发。

艾美耳球虫是一类重要的肠道病原,其裂殖生殖阶段的虫体逸出过程是造成畜禽肠道破坏的主要原因之一,但此逸出过程的机制仍鲜有报道。本研究以乙醇作为诱导剂研究柔嫩艾美耳球虫M2e株子孢子从宿主细胞中逸出的机制。结果显示,乙醇可诱导子孢子从MDBK细胞中逸出,此逸出过程依赖于虫体的运动能力;同时,乙醇可激发子孢子逸出相关的微线体蛋白2(Mic2)的分泌释放。进一步实验证实,螯合虫体内部钙离子明显阻断了子孢子逸出及Mic2蛋白的释放。本研究初步证实了与柔嫩艾美耳球虫逸出相关的蛋白和离子,为深入解析球虫致病的分子机制、研发新型抗球虫药物提供了新的研究方向。

兔球虫病由艾美耳属球虫寄生于消化道而引起,对养兔业的危害极大。由于兔艾美耳球虫的11个虫种在致病性上有较大差异,因此进行准确的虫种鉴定对兔球虫病的诊断和防治有十分重要的意义。为提高和扩大PCR方法检测粪便样品中艾美耳球虫的灵敏度和应用范围,我们利用全基因组扩增技术对提取自粪便样品的球虫基因组进行预扩增,提高PCR反应初始模板含量,再利用兔艾美耳球虫ITS-1序列种特异性引物对WGA产物进行PCR扩增,以鉴定虫种。结果显示,经全基因组扩增后的样品的PCR检测能够在单个卵囊的水平上进行虫种鉴定。利用该方法,我们对10份卵囊含量较少的田间兔粪样品进行了PCR检测,对其中的虫种进行了的鉴定。检测结果显示,与卵囊形态鉴定相比,该方法不仅与能确定形态的形态学检测结果一致,还能够检测出形态学不易判断的虫种,体现了更高的准确性。该技术的应用可提高田间样品检测的敏感性和准确度,为兔球虫临床感染情况提供实践指导。

艾美耳属Eimeria球虫是寄生于多种动物的一类细胞内寄生原虫。近年来随着荧光报告基因及药物筛选基因的应用,艾美耳属球虫的转基因研究取得了较为可喜的突破。转基因艾美耳球虫为球虫生物学、免疫学和遗传学研究提供了很好的研究材料。本文将对艾美耳球虫转基因研究取得的突破、所使用的转基因及鉴定技术,以及转基因球虫的潜在应用作一综述。

兔球虫是一类专性寄生于兔消化系统的顶复门原虫,能够引起家兔严重的寄生虫病,对养兔业造成极大的危害。疫苗免疫一直被认为是防控球虫病最为安全有效的方法,遗憾的是由于对兔球虫免疫学特性的研究不够深入,当前尚无疫苗问世,因此开展兔球虫病疫苗研究对于家兔养殖业有着十分重要的意义。以减毒早熟株作为疫苗进行免疫是球虫病疫苗的理想形式,目前已成功选育多个兔球虫早熟株,并在试验中证实了其能够为家兔提供良好的免疫保护。本文综述了近年来家兔抗球虫免疫和疫苗研发领域的相关研究成果,以期为今后兔球虫的免疫学研究和疫苗研发提供参考。

兔球虫病是危害养兔业的重要寄生性原虫病。当前防治兔球虫病最有效的方法依然是药物防治。本文参考国内外兔球虫病药物防治研究进展,对磺胺类、三嗪类、胍类、离子载体类等化学合成药物、离子载体类抗生素及中药制剂进行综述,并分析药物使用中存在的问题,包括药物残留、耐药虫株的出现等,旨在为今后药物预防兔球虫病提供参考。